各位小伙伴在实验分析中应该都遇到过这类问题,在液相色谱中,对于组分复杂的样品,采用一种色谱体系,往往很难得到理想的分离效果,要么分离时间太长,要么分离度太差。这种情况,采用梯度洗脱就可以缩短分析时间,提高分离效果。下面和大家分享一则梯度微调实例,一起感受下梯度微调对分离效果的奇妙影响吧。

1、尽量在能长时间测试该项目的仪器上开发方法;

2、需要了解系统的性能,避免出现仪器系统改变后不能重现的问题;

3、要知道系统的两个基本情况:梯度滞后体积和比例精确性。这可以在同一个实验里得到这两个数据:参考《JJG 705 2014液相色谱仪检定规程》中《梯度误差》实验:在B溶液(0.1%丙酮)后加紫外检测器,设置一个多阶层的梯度,B溶液以5%的幅度从0%变到100%,流速与平常一样,流速为1mL/min。每段梯度大概保持5min。然后接二通运行梯度,记录图谱。每段梯度设置的时间与实际发生的梯度时间之差就是梯度延迟时间,阶层的高度可以用来测量流动相比例,这些阶层可能有点模糊,是由系统中混合体积造成的;

4、检测完系统,就可以按照它的性能来设计方法。梯度方法转换*大的问题是梯度滞后体积,如果知道仪器的滞后体积比*初开发方法的仪器大,就要自觉的在方法前加一段等度来抵消这一差别,如果目标系统滞后体积小,就要在转移方法的时候在方法开始加一段梯度延迟时间,如果比例差别是在梯度运行中间出现的,也可以通过调节梯度图谱来抵消这种差别,但是一般很少遇到过需要这么做的情况。

5、初始流动相没有充分平衡。柱子已经用初始流动相平衡了,但在分析中,梯度变化很快,而柱子没有用初始流动相充分平衡好,这样di一针时总是与后面的不一样。但是如果转移到有不一样滞后体积的系统时,可能就是另一种情况。

项目背景

名称:12种酚类

色谱柱:月旭Ultimate ® AQ-C18 4.6mm*150mm,5μm

流动相A:水 流动相B:乙腈

问题:柱子正常活化进样,基线和整体出峰均不理想,分离度较差。

1.柱子在运输或储存过程中保存液发生变化,导致填料产生微小改变,碳链蜷缩,未舒展开来,对目标物的保留造成影响;

2.仪器系统存在梯度滞后,在梯度变化过程中,两相混合不精准,导致的物质分离问题;

3.目标物受溶剂效应影响;

4.梯度变化过快,流动相的洗脱能力太强,导致色谱峰未达到分离效果。

1.测试梯度滞后体积和比例精确性;

2.用初始流动相0.2流速过夜平衡柱子;

3.样品用初始流动相溶解(慎用,改变样品溶剂后需要验证样品溶液的稳定性);

4.调节梯度,减缓洗脱速率,减小洗脱能力;

基线和峰形大有改善,但是*一个峰在梯度时间外出峰了。

梯度变化中,水相速率增长较快,物质保留变强,没有获得足够的洗脱能力,*一个物质出峰较晚。

前段分离好的梯度不做调整,调整*一个物质出峰梯度阶段的有机相比例,增加洗脱能力。

以上说明,项目的成功与否,不仅取决于色谱柱类型,仪器条件,还有方法的建立。其中流动相便是考察重点,流动相梯度洗脱必要时可以充分应用上,他是由几种不同极性的溶剂组成,通过改变流动相中不同时间段各溶剂组成的比例改变流动相极性,使每个流出的组分都有合适的容量因子,并使样品的所有组分在*短时间内实现佳分离。好啦,今天的分享就先到这,希望能对小伙伴们有所启发有所帮助哦。

系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。

其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部位。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、与柱或保护住、柱温控制器等,现代HPLC仪还有微机控制系统,进行自动化仪器控制和数据处理。

下面就介绍下高效液相色谱使用中的几个重要环节吧。

实验前的准备工作

1.过滤流动相。为了保证流动相洁净,流动相使用前都必须微膜过滤。

2.流动相脱气。为了避免流动相中气泡对仪器(气泡可能会对仪器及相关设备的正常使用及寿命产生一定影响)及分析结果的影响。

3.运行液相泵前尽量先清洗泵柱塞部件。清洗液一般采用10%甲醇溶液,也有采用10%异丙醇溶液

(5%甲醇或异丙醇等有机相溶液能避免微生物污染,但浓度不能太高,高于20%缓冲液可能会导致盐结晶析出,碰到酸碱类物质可能会有比较强烈的反应;另外异丙醇粘度较大,清洗能力较强;也有采用纯水清洗的,这样如果仪器每天使用还行,如果长期不用,为了防止微生物繁殖,纯水还得用含有有机相的清洗液置换出去)

冲洗,这是为了保护泵柱塞和密封圈等部件在泵运行时不被结晶盐等磨损而导致泵头漏液。

4.每天运行仪器前先排气。一般的液相色谱仪都有排气功能,没有的可以不接色谱柱开机运行几分钟排气。

5.泵运行时尽量不采用大流量模式(主要是换流动相或排气泡等,流量尽量设为3.0ml/min以内,这样更有利于保护泵柱塞杆和密封圈等部件的寿命)。

6.分析前先对色谱系统(整个流路)进行冲洗及平衡,尤其是色谱柱。先用纯甲醇冲洗30分钟,再换10%甲醇水溶液冲洗30分钟,*换含缓冲盐或酸碱类物质的流动相平衡30分钟。色谱柱如果长期没用,每一步冲洗、平衡量尽量为色谱柱柱容量20倍以上)。

如果流动相中不含缓冲盐或酸碱类物质,纯甲醇冲洗完可直接换为流动相。使用色谱柱前知道或怀疑色谱柱中残留有或酸碱盐类物质,在用纯甲醇冲洗前增加一步10%甲醇水溶液冲洗。

7.如果色谱柱需要控温(升温),要先运行泵后再设柱温箱温度。

8.待仪器运行稳定后(基线基本走平后,这个是经验值),方可进样。

样品前处理

1.样品浓度不要太大,杂质不要太多,否则色谱柱处理起来压力很大。

2.进样前样品一定得先经微膜(一般采用0.22um或0.45um微膜)过滤。

实验过程中注意事项

1.为了避免进样器残留影响,进样前先对进样器进行清洗(这个不是必须的,但尽量是每进一针样品或标准品前都清洗进样器和进样针,当然同一样品也可以不洗,不同样品尽量洗),清洗顺序为纯水、甲醇、流动相。

2.每进一针样品后要对系统进行一次冲洗、平衡后再进下一针样品(等度要求不高,梯度要求相对高,主要是冲洗色谱柱中残留的强保留物质)。

实验完毕的后续工作

1.做完样要先清洗进样器,清洗顺序为纯水、甲醇。

2.关闭柱温箱温度设置。

3.冲洗色谱系统及色谱柱。先用10%甲醇水溶液冲洗30分钟后换为纯甲醇冲洗30分钟,待基线基本走平停泵。如果流动相中不含缓冲盐或酸碱类物质,冲洗时流动相可直接换为纯甲醇。色谱柱用完后如果长时间内不会再用,纯甲醇冲洗量要大于色谱柱柱容量20倍以上的,冲洗后卸下,两端密封保存。

4.待色谱柱温度降至接近于室温时再停泵、关机(这一点需特别注意,目的是防止温度过高损坏色谱柱)。

5.关机前用清洗液清洗柱塞杆。